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本制品是一种经过基因工程改造的高保真DNA聚合酶，具有极强的3'→5'核酸外切酶活性（Proof-reading活性），当聚合反应发生碱基错配时，聚合酶的校正活性可将错配的碱基切除。与普通Pfu酶相比，保真性更高，约为普通Taq酶的80倍。其扩增性能也比普通Pfu酶高，成功克服了普通Pfu酶扩增效率低的缺陷。

用于要求保真度高的PCR反应，包括克隆PCR、DNA片段拼接、引入突变、全基因合成、DNA片段的补平等。


在74℃条件下，30分钟内催化10nmol dNTPs的掺入反应成为酸不溶性物质所需的酶量为一个单位。

组分	250U	1250U
KOF高保真DNA聚合酶(1U/μL)	250μL	250μL×5
10×KOF Buffer with Mg2+	1mL×2	1mL×10
dNTPs(10mM each)	250μL	250μL×5

保存：-20℃


经多次柱纯化，SDS-PAGE检测纯度大于95%，qPCR方法检测无大肠杆菌DNA残留，无核酸内、外切酶污染。


KOF超保真DNA聚合酶产生的PCR产物为平末端，无3'端"A"突出，除使用一步定向克隆试剂盒(货号：JN3020)外，其它PCR产物的克隆方案有：

• PCR扩增前引物进行5'加磷修饰或将PCR产物磷酸化处理后再直接克隆于平末端的载体中；
  
• 将扩增产物3'末端加A后再与T载体连接；
  
• 引物中引入15bp与载体同源序列，利用一步定向克隆试剂盒直接连接到目的载体；
  
• 由于KOF超保真DNA聚合酶的校正活性可引起引物从3'端被部分降解。因此在设计引物时应适当增加引物长度，理想引物长度为20～30bp。另外为了减少由3'→5'外切酶活性引起的引物降解，尽量在冰上配制反应体系，并最后加入KOF超保真DNA聚合酶。

• 2mM Mg²⁺可满足绝大多数PCR扩增，对于某些PCR，为了保证较好的扩增，可调节为2～4mM。
  
• 体系中加入推荐的酶量，可以满足大多数PCR扩增，对于某些PCR，为了得到较好的扩增，可适当增加酶量。

图1．50μL扩增体系中，以5ngλDNA为模板，对0.6kb～12.0kb片段的扩增结果。
泳道1：0.6kb；泳道2：1.0kb；泳道3：2.0kb；
泳道4：3.0kb；泳道5：4.0kb；泳道6：8.0kb；
泳道7：10.0kb；泳道8：12.0kb；泳道M：1kb DNA Marker；

• 常用反应体系（50μL）
  

  成分	用量
  10×KOF Buffer with Mg2+	5μL
  上游引物	0.2～1.0μM(终浓度)
  下游引物	0.2～1.0μM(终浓度)
  dNTP(各10mM)	1.0μL
  模板	1～50ng（质粒）
  	10ng～1μg(基因组)
  KOF高保真DNA聚合酶(1U/μL)	1μL (1U)
  ddH2O	至50μL

• 常用PCR循环：
  
  • 当扩增片段＜3K：
    

    反应阶段	温度	时间	循环数
    预变性	94℃	10min	1
    变性	94℃	20s	30
    退火	50～60℃	20s
    延伸	72℃	1kb/60s
    终延伸	72℃	5min	1
    保温	4℃	-	1

  • 当扩增片段≥3K（推荐引物长度≥30bp）：
    

    反应阶段	温度	时间	循环数
    预变性	94℃	5min	1
    变性	94℃	5s	30
    退火/延伸	68℃	1kb/60s
    终延伸	72℃	5min	1
    保温	4℃	-	1

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